新冠状病毒检测为何会出现“假阴性？

新型冠状病毒（2019-nCoV）是冠状病毒，由RNA核酸和蛋白等组成，RNA很容易降解，蛋白衣壳将RNA包裹在其中，加上一层由脂质和糖蛋白组成的包膜外衣，从而使其RNA得到保护。病毒通过特定细胞表面的受体入侵细胞造成感染，并且利用宿主细胞进行复制增殖。冠状病毒亚科分为α、β、γ和δ四个属，新型冠状病毒属于β属。新型冠状病毒与中东呼吸综合征相关冠状病毒MERSr-Cov、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒SARSr-Cov一样，都会引起上呼吸道感染，可引起肺炎、甚至重症肺炎，且可人传人。

图片来源：美国卫生研究院（NIH）官网

中国科学院武汉病毒研究所石正丽团队从早期的5位患者样本中获得了该病毒的全基因组序列。从支气管肺泡灌洗液(BALF)中收集五个重症患者的样本(WIV04)，采用测序NGS的宏基因组学分析方法，在1038758个总读长或人类基因组筛选获得的1582个总读长中，有1378个(87.1%)序列与SARSr-CoV匹配(图2a)。该病毒基因组由冠状病毒常见的6个主要开放阅读框(ORFs)和一些其他辅助基因组成(图2b)。

图2来源：Peng Zhou，Zheng-Li Shi，et al.

目前新型冠状病毒的常规检测方法为核酸检测：实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）方法。其检测原理为：一条RNA链逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA片段扩增，再通过荧光探测来标定扩增的DNA片段是否存在。该方法能够检测细胞中的RNA病毒的含量。我国国家卫健委提出的针对新型冠状病毒的检测标准，需要对病毒的多个保守目标序列上的两个目标靶点（ORFlab、N）均进行扩增检测，只有当两个都显示阳性了，才能确诊。

根据专家介绍，从现在的情况看，根据收集到的病毒样本都是相同的，并没有出现变异的情况。

从原理上来看，RT-qPCR是能够直接快速从人体中找出是否存在新冠状病毒RNA序列。我国在检测过程中选用的是多个保守目标序列，即不容易发生变异的学历片段上的靶点。

核酸检测方法的最大特点是特异性高、灵敏度高，但最大的弱点是易受污染影响。样本采集的时间，方法以及处理均会对检测结果有影响。

根据中国国家卫健委颁布的《新型冠状病毒实验室检测技术指南》，采集标本的种类里有上呼吸道标本（咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物），下呼吸道标本（深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本），血液标本，血清标本，后来又增加了粪便、肛拭子。而在实际操作中，采取最多的是咽拭子、鼻拭子之类的上呼吸道标本。一些特定的疑似感染的患者，不同的病期，在不同的身体部位出现病毒的浓度会有差异，如咽部没有，但可能粪便中有。因此会出现“假阴性”的结果。

采集时让患者张大嘴后用特制棉签或小刷头刮取其咽部采集带病毒标本。如果平时医护人员咽拭子取样不多，刮取标本时患者的反应又比较大，往往导致刮取标本的位置不对，或力度和时间不够，没有刮取到带病毒的标本或刮取到的带病毒标本量少，最后导致检测结果阴性。

一旦在实现过程中操作不当，出现污染，如RNA酶污染，则会直接影响检测结果。此外对样本的处理保存也有严格的标准。2019-nCoV为RNA病毒，很容易被外源性或细胞破坏后所释放的RNA酶降解，而影响最后的检测效率。建议标本采集后及时送检，及时检测（4小时）。如因某些原因标本采集后不能及时送检或及时检测，应将其置保存：4℃，＜24小时； -70℃以下，≥24小时；并且避免反复冻融。

还有一种可能性，检测本身是准确的，只是这些患者在做前几次检测的时候还没有感染。然而，随着时间进程，他们后来被感染了，最终检测结果呈阳性，确诊。

对于新冠病毒的核酸检测，无论是在规范样本采集还是提高试剂检测灵敏度等等方面，都是需要完善的。核酸检测仍是当前最准确和灵敏的新冠病毒检测方法。专家指出，对高度怀疑的有流行病学史的病例，还是要多次采样，此外还应该根据病人在临床上的症状、体征等情况以及CT影像等其他检测结果来综合判断。

总之，病毒没有出现变异，疑似患者首先要做的仍旧是及时隔离，接受检查。面对疫情，我们自身要做好防护工作，勤洗手，多通风，出门戴口罩，不信谣，不传谣！没有一个冬天不会逾越，没有一个春天不会到来，中国加油！

参考文献：

[1]Zhou P,Zhou P, Yang XL, et al.Wang XGPneumoniaoutbreak is associated with a novel coronavirus of likely bat origin.Nature.2020 Feb 3. doi: 10.1038/s41586-020-2012-7.

[2]国家卫健委