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终结“玄学”提取：小鼠原代肝实质细胞标准化制备指南
127 人阅读发布时间：2026-06-04 13:39
做肝脏相关研究的小伙伴们，提取小鼠原代肝实质细胞（PHH）是否成了你科研路上的“拦路虎”？
作为肝脏代谢、药物毒理及肝病机制研究的黄金体外模型，其价值毋庸置疑，但传统方法的低活率、低纯度和不可重复性往往让人头疼不已。
别担心！我们为你带来了一套标准化的小鼠肝实质细胞提取专用试剂盒，旨在帮你告别“凭经验做实验”的时代，即使是新手也能稳定获得高活率、高纯度的细胞。
以下是详细的实验操作指南，助你轻松攻克这一难题！
配套试剂：Perfusate I（灌流液 I）、Perfusate II（灌流液 II）、Culture Medium（基础培养液）、Purification Solution（纯化液，Percoll体系）。
必备耗材：蠕动泵、恒温水浴锅、手术器械、培养皿、离心管、无菌注射器、70μm无菌滤网。
环境要求：全程在超净台进行无菌操作，所有试剂需提前预热至37℃。
02 动物准备
选用 6–8周龄 的健康小鼠（雌雄不限），实验前需禁食12小时（不禁水）。
这一操作旨在减少肝内糖原储备，从而显著提升后续提取细胞的代谢活性。
关键提示：灌流全程需避免气泡产生，气泡会导致肝组织局部坏死，大幅降低细胞得率。
1.麻醉固定：腹腔注射麻醉剂，将小鼠仰卧位固定于解剖板，用75%酒精充分消毒腹部皮肤。
2.暴露血管：沿腹中线剪开腹腔，拨开肠道，清晰暴露门静脉与下腔静脉。
3.预灌流（Perfusate I）：门静脉插入灌流针并固定，启动蠕动泵（流速3–4 mL/min），剪开胸腔下腔静脉作为流出道。持续灌流直至肝脏完全变为土黄色、血液彻底洗净（约5–8分钟）。
作用：洗去血细胞和淤血，松弛肝窦结构。
4.酶消化灌流（Perfusuit II）：切换为含优化消化酶的Perfusate II，保持同等流速继续灌流8–12分钟。
观察指标：当肝脏明显膨松、包膜起皱、质地变软时，即可停止灌流。
1.小心完整取下肝脏，转移至无菌培养皿，剔除胆囊及结缔组织。
2.将肝组织剪碎，加入少量基础培养液，用无菌镊子轻柔撕扯、吹打，促使细胞充分散出。
3.将细胞悬液过 70μm无菌滤网，去除组织残渣，收集滤液至离心管。
利用密度梯度离心去除肝星状细胞、内皮细胞等非实质细胞：
初步离心：滤液500 rpm离心3分钟（室温），弃上清，收集细胞沉淀。
重悬叠加：用预冷基础培养液重悬细胞，缓慢叠加至预配制的Purification Solution梯度液上层。
梯度离心：1500 rpm离心10分钟（4℃）。肝实质细胞会富集在下层细胞带，需小心吸取该目标细胞层。
洗涤：加入基础培养液稀释洗涤，再次低速离心（500 rpm，3 min），弃上清，完成纯化。
用Culture Medium完全培养液重悬细胞，进行台盼蓝染色计数。合格活率应≥85%。
按常规密度 (1×10⁶ 个/mL) 接种至培养板或培养瓶，置于37℃、5% CO₂培养箱中。
换液：静置培养4–6小时后换液，以去除未贴壁的死细胞和杂细胞，随后进行常规培养或实验。。
静置培养前与培养6h后换液细胞状态
0h时：
1.圆球形、折光极强；大小均一，个头明显比其他细胞大；
2.细胞膜完整、圆润透亮，无皱缩；
3.完全不贴壁，全部漂在培养基里。
培养6h时：
1.从圆形 慢慢摊开，变成多边形、鹅卵石形态；
2.胞质均匀透亮，很多能看到双核（肝细胞标志性特征）；
3.细胞边界清晰，开始互相靠拢成片。
我们的一站式试剂盒整合了提取、纯化、培养全流程所需试剂，无需额外采购零散耗材，省心省力！
为了确保实验万无一失，请务必关注以下关键细节：
● 严控消化时间：消化时间过短会导致解离不充分，过长则会造成酶损伤细胞膜，导致死亡率飙升。
● 保持低温离心：纯化步骤的离心必须在 4℃ 进行，以降低细胞代谢损伤，保证活性。
● 全程无菌操作：原代细胞极易受污染，请确保所有试剂与器械严格无菌。
